Eksamensmaskinen

DNA-kloning betyr å sette et bestemt DNA-fragment inn i en vektor, vanligvis et plasmid, og la bakterier kopiere det slik at man får mange identiske kopier av fragmentet.

1. Fremstille fragmentet. Fragmentet isoleres, for eksempel ved å oppformere det med PCR eller ved å kutte det ut av et større DNA-molekyl med restriksjonsenzymer.

2. Kutte fragment og plasmid. Fragment og plasmid kuttes med samme restriksjonsenzym. Restriksjonsenzymer kutter DNA ved bestemte gjenkjenningssekvenser, ofte palindromiske, og mange gir forskjøvne kutt med enkelttrådete, «klebrige» ender. Fordi samme enzym er brukt, er endene på fragment og plasmid komplementære.

3. Sette sammen. Fragment og åpnet plasmid blandes. De komplementære endene baseparer med hydrogenbindinger. DNA-ligase danner deretter kovalente fosfodiesterbindinger i sukker-fosfat-ryggraden, slik at det dannes et lukket, rekombinant plasmid.

4. Transformasjon. Plasmidene føres inn i bakterier, for eksempel E. coli som er gjort kompetente med varmesjokk eller elektroporering. Bare en liten andel av bakteriene tar opp et plasmid.

5. Seleksjon. Plasmidet har en seleksjonsmarkør, typisk et gen for antibiotikaresistens. Bakteriene dyrkes på skåler med antibiotikum, slik at bare bakterier som har tatt opp et plasmid overlever og danner kolonier.

6. Finne riktig innskudd. Resistens viser bare at bakterien har et plasmid, ikke at plasmidet inneholder riktig fragment; plasmidet kan for eksempel ha lukket seg uten innskudd. Koloniene må derfor undersøkes, for eksempel med PCR, kutting med restriksjonsenzym etterfulgt av gelelektroforese, eller sekvensering.

7. Oppformering. En koloni med riktig innskudd dyrkes opp i flytende medium. Plasmidet har et replikasjonsorigin som fungerer i bakterien, så det kopieres hver gang bakteriene deler seg, og man får mange kopier av fragmentet som kan renses ut.

Et kloningsplasmid må altså ha et replikasjonsorigin, en seleksjonsmarkør og et kloningssete der fragmentet kan settes inn. Kloning gir kopier av DNA-et; skal genet også uttrykkes som protein, trengs i tillegg egnede regulatoriske sekvenser som en promotor.

Cellesyklusen er rekkefølgen av hendelser der en celle kopierer innholdet sitt og deler seg i to datterceller med identisk arvemateriale.

Fasene. I G1 vokser cellen og vurderer om forholdene ligger til rette for deling; celler kan også gå ut i G0 og slutte å dele seg. I S-fasen replikeres DNA, slik at hvert kromosom består av to søsterkromatider holdt sammen av cohesin. DNA-mengden dobles, men antall kromosomer er det samme. I G2 forbereder cellen mitose og kontrollerer at DNA er ferdig replikert. G1, S og G2 utgjør interfasen. I M-fasen skjer mitose (kjernedeling) og vanligvis cytokinese (deling av cytoplasma).

Regulering med syklin–Cdk. Cellesyklusen styres av syklinavhengige kinaser (Cdk). En Cdk er bare aktiv når den har bundet et syklin. Syklinnivåene stiger og faller gjennom syklusen, så ulike syklin–Cdk-komplekser (G1-, G1/S-, S- og M-Cdk) er aktive til ulike tider. Aktive komplekser fosforylerer målproteiner som driver cellen inn i neste fase. Aktiviteten reguleres i tillegg av hemmende og aktiverende fosforylering og av Cdk-hemmere, og syklinene brytes ned når de har gjort jobben sin, slik at hendelsene skjer i riktig rekkefølge og ikke gjentas.

Kontrollpunkter. Ved G1-kontrollpunktet sjekkes vekstbetingelser og DNA-skade før replikasjon. Ved DNA-skade stabiliseres p53, som øker uttrykket av p21. p21 hemmer syklin–Cdk, slik at syklusen stanser og skaden kan repareres; ved alvorlig skade kan p53 utløse apoptose. Ved G2/M-kontrollpunktet sjekkes at DNA er ferdig replikert og uskadd. Spindelkontrollpunktet i mitosen sjekker at alle kromosomer er festet riktig til spindelen før søsterkromatidene skilles.

Mitosen. I profasen kondenseres kromosomene og spindelen begynner å dannes fra sentrosomene. I prometafasen brytes kjernehylsteret ned, og mikrotubuli fester seg til kinetokorene. I metafasen ligger kromosomene på metafaseplaten med søsterkromatidene festet til hver sin pol. I anafasen skilles søsterkromatidene og trekkes mot hver sin pol. I telofasen dannes nye kjernehylstre, og kromosomene dekondenseres.

Anafasestart. Når spindelkontrollen er tilfredsstilt, aktiveres APC/C, som merker securin for nedbrytning. Securin har holdt separase hemmet; fri separase spalter cohesin, og søsterkromatidene kan skilles. APC/C bryter også ned M-syklin, slik at mitosen avsluttes.

Cytokinese. I dyreceller snører en kontraktilring av aktin og myosin cellen i to. Resultatet er to datterceller med hvert sitt komplette, identiske kromosomsett.

DNA-replikasjon er kopieringen av DNA før celledeling; hos eukaryoter skjer den i S-fasen. Replikasjonen er semikonservativ: hvert nye DNA-molekyl består av én gammel tråd som har vært mal, og én nysyntetisert tråd.

Oppstart. Replikasjonen starter ved replikasjonsoriginer, som ofte er AT-rike fordi A–T har bare to hydrogenbindinger og er lettere å åpne. Initiatorproteiner (hos eukaryoter ORC) binder originet. Eukaryote kromosomer har mange originer, slik at det store genomet kan kopieres raskt. Fra hvert origin går replikasjonen i begge retninger og danner en replikasjonsboble med to replikasjonsgafler.

Åpning. Helikase bryter hydrogenbindingene mellom basene og skiller trådene. SSB-proteiner stabiliserer det enkelttrådete DNA-et så det ikke baseparer igjen. Topoisomerase fjerner vridningsspenningen som bygger seg opp foran gaffelen.

Syntese. DNA-polymerase kan ikke starte en ny tråd selv, men bare forlenge fra en fri 3′-OH. Primase lager derfor en kort RNA-primer. DNA-polymerase leser malen 3′→5′ og syntetiserer ny tråd 5′→3′ ved å sette inn komplementære nukleotider.

Leading og lagging strand. Fordi trådene er antiparallelle og polymerasen bare syntetiserer 5′→3′, blir de to nye trådene laget forskjellig. Leading strand syntetiseres kontinuerlig i samme retning som gaffelen beveger seg, og trenger bare én primer. Lagging strand syntetiseres diskontinuerlig bort fra gaffelen, i korte Okazaki-fragmenter, og trenger en ny primer for hvert fragment. Begge trådene syntetiseres 5′→3′.

Ferdigstilling. RNA-primerne fjernes og erstattes med DNA (hos bakterier gjør DNA-polymerase I dette). DNA-ligase lukker de gjenværende bruddene i sukker-fosfat-ryggraden ved å lage fosfodiesterbindinger, så Okazaki-fragmentene blir én sammenhengende tråd.

Proofreading. Replikative DNA-polymeraser korrekturleser. Settes feil nukleotid inn, flyttes 3′-enden fra polymeriseringssetet til et eksonukleasesete, der feilen fjernes med 3′→5′-eksonukleaseaktivitet, og syntesen fortsetter 5′→3′. Dette gir svært lav feilrate.

Én gang per syklus. Hos eukaryoter klargjøres originene i G1 (pre-replikasjonskompleks med ORC og Cdc6) og aktiveres av S-Cdk i S-fasen. Siden nye kompleks ikke kan dannes før neste G1, kopieres DNA nøyaktig én gang per cellesyklus. Resultatet er to identiske DNA-molekyler.

PCR (polymerasekjedereaksjon) er en metode for å oppformere et bestemt DNA-område mange ganger i et reagensrør, uten levende celler.

Komponentene. En DNA-mal inneholder sekvensen som skal kopieres. To primere er korte, enkelttrådete DNA-biter som er komplementære til hver sin ende av målområdet, på hver sin tråd. De avgrenser hvilket område som oppformeres og gir den frie 3′-OH-enden polymerasen trenger. En varmestabil DNA-polymerase, for eksempel Taq fra bakterien Thermus aquaticus, syntetiserer nytt DNA. Den må tåle høy temperatur fordi reaksjonen varmes til rundt 95 °C i hver syklus; en vanlig polymerase ville blitt denaturert. dNTP-er (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) er byggesteinene. Buffer og Mg²⁺ gir riktige betingelser; Mg²⁺ er nødvendig for polymerasens aktivitet.

Syklusen har tre trinn.

1. Denaturering, rundt 95 °C: hydrogenbindingene brytes og trådene skilles. I PCR gjør varmen jobben som helikase gjør i cellen.
2. Primerbinding (annealing), rundt 50–65 °C: temperaturen senkes slik at primerne baseparer med sine komplementære sekvenser. Temperaturen tilpasses primerne.
3. Forlengelse, rundt 72 °C: Taq-polymerasen forlenger fra primernes 3′-ender og syntetiserer ny tråd 5′→3′.

Oppformering. Primernes 3′-ender peker mot hverandre, inn mot målområdet. De nye trådene fungerer som mal i neste syklus, så antallet målsekvenser dobles omtrent per syklus. Etter n sykluser er oppformeringen ideelt 2ⁿ; etter 30 sykluser er det omtrent en milliard kopier. Fra tredje syklus begynner dobbelttrådete produkter med nøyaktig lengde mellom primerne å dominere. I praksis er effektiviteten under 100 %, og reaksjonen når til slutt et platå når reagensene brukes opp.

Forskjell fra cellulær replikasjon. PCR bruker varme i stedet for helikase, ferdiglagde DNA-primere i stedet for RNA-primere fra primase, og kopierer bare et avgrenset område i stedet for hele genomet. Produktet kan kontrolleres med gelelektroforese og brukes videre, for eksempel i kloning.

DNA lagrer genetisk informasjon i rekkefølgen av nitrogenbaser. Det er en polymer av nukleotider.

Nukleotidet. Hvert nukleotid består av sukkeret deoksyribose, en fosfatgruppe og en nitrogenbase: adenin (A), guanin (G), cytosin (C) eller tymin (T). A og G er puriner med to ringer; C og T er pyrimidiner med én ring.

Tråden. Nukleotidene i én tråd er bundet sammen av kovalente fosfodiesterbindinger mellom 3′-OH på ett sukker og fosfatet på 5′-karbonet på neste. Dette gir en sukker-fosfat-ryggrad med retning: én 5′-ende med fosfat og én 3′-ende med OH.

Dobbelheliksen. DNA består av to tråder som er komplementære og antiparallelle: den ene går 5′→3′, den andre 3′→5′. Basene vender innover og baseparer med hydrogenbindinger: A med T via to hydrogenbindinger, G med C via tre. Fordi et purin alltid parer med et pyrimidin, har heliksen jevn diameter. Sukker-fosfat-ryggraden vender utover og er negativt ladet. Trådene snor seg rundt hverandre i en høyrehendt dobbelheliks med stor og liten fure, der proteiner kan lese sekvensen. Heliksen stabiliseres av hydrogenbindingene og av basestabling. Fordi trådene er komplementære, kan hver tråd brukes som mal for en ny, og det er grunnlaget for replikasjon.

Pakking. DNA og proteinene det er bundet til, kalles kromatin. Første nivå er nukleosomet: DNA viklet nesten to ganger rundt en kjerne av åtte histonproteiner, to av hver av H2A, H2B, H3 og H4. Nukleosomene er forbundet med linker-DNA, som perler på en snor. Histonene er positivt ladet og binder det negativt ladde DNA-et. Nukleosomene pakkes videre til tettere fibre og løkker, og under mitose kondenseres kromatinet maksimalt til synlige kromosomer.

Eukromatin og heterokromatin. Eukromatin er løsere pakket og tilgjengelig for transkripsjon; heterokromatin er tett pakket, og gener der uttrykkes lite. Pakkingen er regulerbar, blant annet ved kjemisk modifisering av histonene og kromatin-remodellerende komplekser. Sammenhengen er at hvor tett DNA er pakket, påvirker om transkripsjonsmaskineriet får tilgang til genene.